Контрольная работа: Аффинность антител и кинетика реакций

Содержание

1. Методы определения аффинности антител................................................ 3

2. Способы расчета констант комплексообразования реакции антиген—антитело 7

3. Кинетические закономерности реакции взаимодействия антиген—антитело 15

1. Методы определения аффинности антител

Возможно вы искали - Реферат: Аффинные иммуносорбенты. Использование радиоактивных изотопов

Определение аффинности антител в сыворотке или выделенных в очищенном виде представляет собой сложную экспериментальную и теоретическую задачу. Трудности обусловлены следующими обстоятельствами.

Во-первых, гетерогенностью антител по физико-химическим свойствам, в том числе по сродству к антигену. Во-вторых, сложностью определения общего количества антител, а также отдельных фракций. В-третьих, в случае поливалентных антигенов возможностью образования комплексов сложного состава, в том числе циклической структуры, в которых проявляется кооперативность взаимодействия активных центров антител. Все это не позволяет применить традиционные методы для расчета истинных значений констант связывания. Более надежные данные могут быть получены для моноклональных антител и их Fab-фрагментов, так как в этом случае могут быть выделены индивидуальные антитела в гомогенном виде.

Истинные значения констант связывания важны для определения термодинамических характеристик процесса взаимодействия · антиген — антитело. Для практических целей, в частности для разработки методов иммуноферментного анализа, достаточно знать эффективные значения, характеризующие свойства используемых антител.

Рассмотрим принципиальные подходы к определению констант равновесия. Из уравнения следует, что для расчетов необходимо знать концентрации свободного и связанного с антителами антигена в условиях равновесия. Обычно для этого используют антигены, меченные маркером, который с высокой чувствительностью может быть определен одним из доступных физико-химических методов.

Все методы, позволяющие определять концентрации свободного и связанного антигена, можно условно разбить на две большие группы. К первой относятся методы, в которых стадия разделения свободного и связанного антигена осуществляется путем избирательного осаждения, аффинного связывания или гельфильтрации. Если реагенты достаточно сильно различаются своими молекулярными массами и размерами, то процедура разделения существенно упрощается. В случае корпускулярных антигенов оставшиеся несвязанные антитела могут быть отделены либо центрифугированием, либо пропусканием смеси через фильтр, задерживающий антиген. Для низкомолекулярных антигенов используется равновесный диализ.

Похожий материал - Реферат: Базидиомицеты

Вторая группа включает методы, базирующиеся на изменении физико-химических свойств антигенов при комплексообразовании с антителами: тушении или усилении флуоресценции, изменении степени поляризации флуоресценции, ингибировании ферментативной активности.

Равновесный диализ — наиболее распространенный метод изучения реакции антиген — антитело. Метод основан на различной способности антител и гаптена проходить через полупроницаемые мембраны. Раствор каждого реагента известной концентрации в одном и том же растворителе с одинаковой ионной силой и значением рН помещают по разные стороны мембраны. Молекулы гаптена диффундируют в раствор антител и связываются с ними. При достижении равновесия концентрация свободного гаптена выравнивается по обе стороны мембраны. Измерив равновесную концентрацию гаптена, можно рассчитать количество гаптена, связанного с антителами, и определить по уравнению константу связывания.

Как правило, метод равновесного диализа применяется для низкомолекулярных соединений с Af_r <3000. Это обстоятельство существенно ограничивает область использования метода. К недостаткам метода надо также отнести относительно большое время достижения равновесия и необходимость учета эффектов, вызываемых присутствием мембраны, в результате чего необходимо работать с достаточно высокими концентрациями реагентов, что значительно понижает чувствительность определения константы связывания.

Методы фракционного осаждения используются для разделения комплексов антиген — антитело и несвязавшегося антигена. Они основаны на способности высокомолекулярных комплексов антиген—антитело избирательно осаждаться различными реагентами. При установлении в системе равновесия осаждающий реагент добавляют в такой концентрации^ при которой комплекс антиген—антитело и несвязавшиеся антитела становятся нерастворимыми и выпадают в осадок, который легко может быть удален центрифугированием.

Методы, не включающие фазовое разделение вступившего и не вступившего в реакцию антигена, относятся к группе гомогенных методов.

Очень интересно - Реферат: Байкальский фаунистический комплекс рыб

Флуоресцентные методы основаны на способности остатков триптофана в молекулах белков флуоресцировать при возбуждении УФ светом. Взаимодействие ряда антигенов с антителами приводит к изменению интенсивности флуоресценции, что может быть использовано для оценки количества антигена, вступившего в реакцию с антителами. В зависимости от химической структуры антигена может наблюдаться как усиление, так и гашение флуоресценции. Степень гашения интенсивности свечения зависит от концентрации активных центров антител, константы их ассоциации с антигеном и пропорциональна концентрации образовавшихся специфических комплексов. Методы флуоресценции просты, не занимают много времени и имеют высокую чувствительность, что сокращает расход реагентов.

Таблица 1. Методы определения аффинности антител